Главное меню.

 

Врач ветеринарной медицины

Деревянко Игорь Павлович.

Тел. +38 0936790517

+380678859689

iderevyanko@ukr.net

Полимеразная цепная реакция

Итак, дорогой читатель, теперь уже ознакомившись в пред идущем номере журнала с ИФА (иммуноферментным анализом), мы переходим к не менее интересной и загадочной аббревиатуре - ПЦР (полимеразной цепной реакции).

 Полимериза́ция (греч. polymeres - состоящий из многих частей) — процесс образования высокомолекулярного вещества (полимера) путём многократного присоединения молекул низкомолекулярного вещества (мономера, олигомера) к активным центрам в растущей молекуле полимера. Молекула мономера, входящая в состав полимера, образует так называемое мономерное звено. Элементный состав (молекулярные формулы) мономера и полимера приблизительно одинаков.

 Обычно мономерами являются соединения, содержащие кратные связи, которые способны, раскрываясь, образовывать новые связи с другими молекулами, обеспечивая рост цепи

Полимеризация была открыта ещё в середине XIX века, практически одновременно с выделением первых способных к полимеризации мономеров (стирола, изопрена, винилхлорида, метакриловой кислоты и др.). Однако суть полимеризации как цепного процесса образования истинных химических связей между молекулами мономера была понята лишь в 20—30-е гг. XX века благодаря работам Г. Штаудингера, С. В. Лебедева, Б. В. Бызова, К. Циглера. В 1922 химик Штаудингер доказал, что полимеры представляют собой соединения, состоящие из больших молекул, атомы которых связаны между собой ковалентными связями

 Ну вот, читайте внимательно, метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК (дезокси рибонуклеиновой кислоты, которая является носителем наследственной информации, не только в клетках организма, но и в  вирусах и в бактериях, которые и есть возбудителями болезней, она же мономер) при помощи специальных веществ, называемых ферментами, не в живом организме, а в пробирке. Такое копирование называется амплификацией (а в живых организмах –репликацией/повторением). В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.

Понятно?

Я лично думаю, что не очень. В принципе скажем так, несомненным достоинством метода является возможность определить в живом организме чрезвычайно малые количества, того, или иного возбудителя.

Высокая специфичность ПЦР (pcr) обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК.

Ну просто фантастика!

Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР помогает обнаружить возбудителей инфекций даже в тех случаях, когда другими видами анализов (бактериологическими, иммунологическими, микроскопическими) это провести нереально. Использование ПЦР весьма эффективно в отношении инфекционных возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов.

Универсальность ПЦР

Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя. Для проведения анализа используются разные биологические выделения (моча, слизь, мокрота и т.д.), кровь, плазма, сыворотка, соскобы эпителиальных клеток, плевральная и спинномозговая жидкости, биоптаты. Анализом ПЦР можно диагностировать сразу несколько возбудителей инфекции из одной биопробы.

Вот это и есть основное отличие ПЦР от ИФА, возможность определить наличие возбудителя.

Анализ ПЦР значительно снижает время получения результатов диагностики. Для проведения ПЦР анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Применение ПЦР также очень эффективно в отношении не только острых, но и вялотекущих, скрытых инфекций.

Анализ ПЦР практически полностью автоматизирован, что дает свободу лаборанту получить результаты в течение краткого времени.

Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т.д.).

Высокая чувствительность ПЦР

ПЦР в настоящее время самый чувствительный метод анализов на венерические заболевания. ПЦР показывает свою эффективность при диагностике трудно культивируемых форм микроорганизмов, с которыми нередко приходится сталкиваться при скрытых и хронических инфекциях ,например хламидии), поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Метод ПЦР позволяет выявлять единичные клетки бактерий или вирусов. Вот как все не просто.

Ну а теперь собственно о методе.

История.

В начале 1970-х годов норвежскому ученому Хьеллю Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны пришла в голову мысль, что можно многократно увеличить количествоДНК в пробирке с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, так называемых синтетических (искуственно созданых) праймеров. Однако, в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию. А нам чего с Нобеля и с умножения причем многократного. Вот это умножение делает метод чрезвычайно чувствительным и, при наличие малого количества возбудителя болезни в организме, все равно дает возможность определить его. 

В момент изобретения метода Маллис работал в компании Цетус (en:Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош (en:Hoffmann-La Roche) за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована русским биохимиком Алексеем Калединым в 1980 году, в связи с чем компания Промега (Promega) пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 г.

Ну что, дорогой читатель, погребем дальше. Чем, или в чем умножать будем?

Основным инструментом для постановки ПЦР служит –амплификатор (удвоитель умножитель и т. д., и т.п.)

Что же это такое?

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое  охлаждение и нагревание пробирок , которое и дает увелечиние количества испытуемого ДНК.

Не буду вникать в суть процессов, происходящих в амплификаторе, но именно он обеспечивает правильное проведение реакции, приводящее к многократному увеличению количества определяемого участка ДНК.

Применение ПЦР

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах.

 В Криминалистике

ПЦР используют для сравнения так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии.

 Установление отцовства

Хотя «генетические отпечатки пальцев» уникальны (за исключением случая однояйцевых близнецов), родственные связи все же можно установить, сделав несколько таких отпечатков. Тот же метод можно применить, слегка модифицировав его, для установления эволюционного родства среди организмов.

 Медицинская диагностика

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.

 Персонализированная медицина

Известно, что большинство лекарств действуют не на всех пациентов, для которых они предназначены, а лишь на 30-70 % их числа. Кроме того, многие лекарства оказываются токсичными или аллергенными для части пациентов. Причины этого — отчасти в индивидуальных различиях в восприимчивости и метаболизме лекарств и их производных. Эти различия детерминируются на генетическом уровне. Например, у одного пациента определенный цитохром (белок печени, отвечающий за метаболизм чужеродных веществ) может быть более активен, у другого — менее. Для того, чтобы определить, какой разновидностью цитохрома обладает данный пациент, предложено проводить ПЦР - анализ перед применением лекарства. Такой анализ называют предварительным генотипированием (англ. prospective genotyping).

Клонирование генов

Клонирование генов (не путать с клонированием организмов) — это процесс выделения генов и, в результате генноинженерных манипуляций, получения большого количества продукта данного гена. ПЦР используется для того, чтобы амплифицировать ген, который затем вставляется в вектор — фрагмент ДНК, переносящий чужеродный ген в тот же самый или другой, удобный для выращивания, организм. Таким образом, в промышленных количествах получают многие белки для использования в сельском хозяйстве, медицине и др.

И прочая , прочая, прочая…

Всего не перечесть, а для справок звоните.

С уважением Деревянко И.П.

Котята в продаже

сканирование фото пленки слайдов

© 2007-2011 kitten-kiev.com.ua

печать, сканирование