Главное меню.

 

Врач ветеринарной медицины

Деревянко Игорь Павлович.

Тел. +38 0936790517

+380678859689

iderevyanko@ukr.net

Современные методы лабораторной диагностики в практической ветеринарной медицине.

Мало кто из владельцев многочисленных питомцев кошек и собак, голубей и кроликов, а, в последнее время и экзотов - игуан, змей, тарантулов, крокодилов и черепах, удовлетворен уровнем предлагаемой лабораторной диагностики, как в частных, так и в государственных клиниках.

Ну в самом деле, это в лучшем случае: общий анализ крови, лейкограмма (формула крови), биохимия крови (специальные химические показатели отражающие работу внутренних органов) анализ мочи, анализ кала на глистную инвазию – методом Фюллеборна, которому уже наверное лет этак с 200.

Задумайтесь, кто из вас когда-нибудь слышал о выделении вируса или бактерии, как возбудителя диагностируемого заболевания? Исключением разве что может быть диагностика лептоспироза ( серологическая ), диагностика бешенства (вирусологическая), ну может быть еще микроскопия на пироплазмоз (бабезиоз).

К сожалению, та диагностика, которая сегодня существует, больше опирается на клинический опыт врача. Чем опытнее доктор, тем лучше диагноз. Такое положение дел не устраивает ни докторов, ни владельцев животных, так как выводит постановку диагноза на уровень веры в доктора. Верим доктору – диагноз правильный, не верим – диагноз не правильный и доктор плохой.

Читатель возразит: ну а как же узи и ренген? К сожалению, оба метода являются подтверждательными и не имеют никакого отношения к проблемам вирусологической, паразитологической и бактериологической диагностике.

Так что, докторам не верить, что ли? Да нет, верить надо, только доктора разные бывают. Ставили же диагнозы: Гален и Гипократ, Авицена и Пирогов без узи, рентгенов и лабораторий.Вопрос не в том, доверять или не доверять, а в том, что живем мы в 21 веке, и, если наука позволяет все делать точнее и лучше, чем прежде, то почему бы этим не пользоваться? Что поможет и врачу (хорошему и не очень) избежать врачебных ошибок, а у владельцев повысит доверие к доктору.

И так, далее речь пойдет об очень интересных вещах, в лабораторной диагностике, совершенно фантастических. Попытка рассказать о том новом, довести до сведенья потребителя, т.е владельца животного и врача. Ибо если они о таких методах не знают (думаю, что и многие врачи не знают), то одни не будут их применять, а другие требовать их применения.

Точная диагностика также позволит решить проблему знахарства в медицине, ведь многие и к докторам не обращаются, думая, что иной заводчик лучше знает, чем доктор.

Извини уважаемый  читатель ,за столь не любимую тобой научною абракадабру, в последующем, но я обещаю ,что мы ее поборем.

Итак ИФА и ПЦР.

Вначале расскажем об ИФА, а потом о ПЦР.

ИФА - иммуноферментный анализ.

Метод иммуноферментного анализа.

Какое устрашающее слово – иммуноферментный. Оно потому и страшное, что не понятное. Попытаемся перевести, что же такое иммуноферментный. Иммунитет (от латинского immunitas, что означает свободный отчего либо ), что же это такое?

 Вам, уважаемый читатель, важно запомнить, что иммунитет – это невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам и веществам, не только к вредным микроорганизмам - бактериям, вирусам, но и к другим агентам, которые чужды для организма.

Различают врожденный и приобретенный иммунитет.

Врожденный иммунитет передается по наследству, так сказать, с молоком матери, и в прямом и в переносном смысле. Приобретенный иммунитет (он может быть активно или  пассивно приобретенным), возникает в результате перенесенной болезни или вакцинации (иммунизации) и по наследству не передается. Иммунитет обеспечивает способность живых организмов противостоять действию агрессивных агентов, сохраняя свою целостность и биологическую индивидуальность. Наследственный иммунитет обусловлен врожденными свойствами организма. У позвоночных и человека имеется способность приобретать активный иммунитет в ответ на инфекцию или введение вакцин (чужеродных, по отношению к организму веществ). Он обусловлен функцией клеток иммунной системы, которые и обеспечивают ее работу. Приобретенный пассивный иммунитет передается ребенку с молоком матери или при искусственном введении антител. При этом, в организм с молозивом попадают специфические факторы защиты – антитела (пассивная защита). В последующем, вот эти специфические факторы защиты, вырабатываются самим организмом и обеспечивают иммунный ответ на чужеродные агенты (антигены), все те же вирусы, бактерии и пр., они же растворимые факторы защиты - антитела (иммуноглобулины) классов M,G, A, D и E.

Понятие иммунитета включает в себя еще очень много, загадочных и интересных штучек: таких как, проницаемость кожных барьеров, гуморальный иммунитет и, не менее загадочный, клеточный, и многое другое, но об этом в другой раз. А для того чтобы понять принцип работы ИФА, важна, способность иммунной системы, вырабатывать вот эти самые видоспецифичные антитела, видоспецифичные, т.е такие, которые будут соответствовать только одному виду, вражеского, по отношению к организму, агенту-вирусу или бактерии, или еще чему-нибудь (антигену). Вот эти самые специфические факторы защиты, занимаются тем, что связывают проникающий в организм вредоносный агент, соответствующий только определенным антителам (другой агент уже не свяжут, нужны другие специфичные антитела) образуя комплекс антиген- антитело.

Наличие этих самых  антител и способность организма их вырабатывать позволяет, не только защитить организм от всяких вредностей путем вакцинации (иммунизации),но и успешно диагностировать их в разных иммунологических реакциях: РА.РЗГА, РИД, РИФ,  и т.д. и.т.п., всех не перечесть, а нас, уважаемый читатель, интересует ИФА. Важно помнить, что все они, основаны на способности, этих самых антител, связывать вредоносные агенты, образовывая комплексы антиген–антитело, вот эти самые комплексы и подлежат определению.

История метода такова: метод иммуноферментного анализа (ИФА), был предложен в начале 70-х годов тремя группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотрудниками. в США. К концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. Что касается гуманной медицины, то в настоящее время ИФА-диагностика является наиболее часто используемым иммунологическим методом в городских и районных больницах, поликлиниках, роддомах, учреждениях санэпиднадзора и других медучреждениях, иное дело ветеринарная медицина. Несмотря на наличие необходимого оборудования в областных лабораториях, этот метод фактически не применяется, ну разве что, при опасности возникновения и необходимости срочной диагностики, птичьего или свиного гриппа, а о районных лабораториях и говорить нечего.

Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу конъюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Конъюгация – от латинского - соединение. Фермент - от латинского - закваска, т.е. это  вещество усиливающие протекание биологических процессов. Вот наличие этого самого конъюгата с ферментом и позволяет сделать метод более точным и надежным и т. д., и т.п. Фермент вызывает разложение хромогенного (цветного) субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо специальными приборами (фотометрами). Вот на этих приборах и проводят регистрацию результатов реакции. Результат выражают в единицах оптической плотности, которые соответственно будут при пересчете показывать наличие или отсутствие антител, их количество, и еще при желании многое другое.

Существует множество  вариантов постановки ИФА, Наибольшее практическое значение получил метод с использованием полистироловых планшетов с лунками, в которые уже нанесен антиген (заводского изготовления).

Не будем описывать все перипетии постановки ИФА, чтобы не замучивать вас абракадаброй. Суть в образовании комплексов антиген - антитело (антиген жестко пришит в лунке на заводе, а антитела предположительно находятся в сыворотке крови или, в том где мы определяем чего то там, которая добавляется в лунку). Если антитела есть, образуется комплекс, не связавшиеся агенты реакции отмывают, а к связанным, т.е комплексам добавляют, вот этот самый фермент, посаженный на видоспецыфичные (например антитела против глобулинов крови человека) вторые антитела, к которым пришит этот самый загадочный фермент, образовавшиеся в результате комплексы называются сандвичами, отмываем от того что не связалось, тот фермент, что остался, т.е не связанный, воздействует на добавляемый бесцветный субстрат(носитель, может быть и обыкновенный физ. раствор) и окрашивает его. УХ как сложно, аж дух захватило.

Проще сказать, не важно что к чему присоединяется и что от чего отмывается, главное, что в результате это все можно увидеть по изменению окраса раствора.

Вот это изменение окраса в лунке и измеряется прибором, и по степени его изменения определяем количество связанных или не связанных антител. Если антитела связаны то заболевание либо было, либо есть, либо животное вакцинировано или иммунизировано. Эти различия можно сделать по количеству оставшихся антител.

 Вот такой вот непростой метод, зато в течение 3х – 4х часов можно получить результат, в лаборатории.

Не вздумайте сами проводить отбор проб, непонятно в какую посуду, пробы(смывы) отбираются, в одноразовые пробирки эпиндорф , одноразовыми шпателями, а пробы крови тоже в одноразовые пробирки с ЕДТА

Процедуру отбора и доставки в лабораторию важно соблюсти, от этого зависит результат анализа.

А что есть лаборатории, в которых это делают?

По крайней мере две в Киеве и одна в Днепропетровске (все частные).

Есть еще одна разновидность твердофазного ИФА - это иммунофлуорохромный ИФА, скоростной и экспресс анализ, не требует лаборатории, на специальную полоску пропитаю антигеном капается, сыворотка, моча и т.д., и т.п., подымаясь по полоске испытуемая жидкость тянет за собой, как вы догадываетесь фермент, в зоне нанесения антигена образуется сандвич, и проявляется окрашенная полоса (при условии образования комплекса, антиген, антитело). Все это можно делать на столе, в поле, да где угодно. Время постановки - 10-15мин.

Что же можно определять таким методом?

Да все: беременность, наличие опухолей, гормонов, и пр.

 Иммуноферментный анализ, по сравнению с другими методами выявления антигенов и антител, обладает следующими преимуществами:

- высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации до 0,05нг/мл. Такая точность метода определяется способностью одной молекулы фермента (смотри выше) катализировать превращение большого числа молекул субстрата (сыворотки, мочи и т. д.)

Понятно, что в связи с этим, возможно использовать минимальные объемы исследуемого материала;

- стабильностью при хранении всех ингредиентов, необходимых для проведения ИФА  (до года и более);

- простотой проведения реакции;

- наличием как инструментального (в качественном и количественном варианте), так и визуального учета;

- возможностью автоматизации всех этапов реакции;

- экологической чистотой и безопасностью для мед. персонала (в отличии от РИА);

-относительно низкой стоимостью диагностических наборов.

О том, что можно определять этим методом, поговорим в следующем опусе(номере), и о ценах тоже.

Котята в продаже

сканирование фото пленки слайдов

© 2007-2011 kitten-kiev.com.ua

печать, сканирование